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Materiales de referencia y comparaciones interlaboratorios
II. Aplicaciones y Desarrollo
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La principal técnica utilizada para liofilización de microorganismos es el secado por congelamiento (“free-
ze-drying”), en la cual se produce un congelamiento de la solución, y posteriormente una reducción de la
presión produce que el agua congelada sublime de sólido a gas [19]. El proceso de congelamiento como tal
es asociado con la perdida de viabilidad de los cultivos [18, 19]. Para contrarrestar este fenómeno son utiliza-
dos generalmente crioprotectores, como es el caso de la leche descremada, los cuales evitan el daño celular
producido en la liofilización [17]. Existen algunas desventajas asociadas con esta metodología como lo son el
tiempo de preparación y los altos costos del proceso. Además se suman a estos los altos costos de transporte
y almacenaje de los cultivos concentrados congelados.
Un método alternativo de liofilización utilizado ampliamente en la industria es el secado por pulveri-
zación (“spray-drying”) [18, 19]. El proceso involucra una evaporación de la humedad al mezclar el pulve-
rizado que contiene a las bacterias y el medio de secado que generalmente es aire caliente. En este tipo
de liofilización también es común utilizar sustancias que previenen el daño celular durante el proceso de
liofilización [19]. No obstante, es importante destacar que este proceso implica exponer a las células a al-
tas temperaturas. Por lo tanto, la temperatura en el proceso de liofilización por pulverización es un de los
parámetros importantes a estudiar y definir para cada tipo de bacteria [18]. Los costos de producción y
transporte para esta metodología son menores que los del secado por congelamiento, y además estos
liofilizados pueden ser almacenadas en una forma estable por períodos prolongados de tiempo [18-20].
Viabilidad bacteriana en los materiales de referencia
Es fundamental que las células liofilizadas, usadas como material de referencia en microbiología, mantengan
una viabilidad alta [18]. Una forma de determinar este parámetro es calcular el porcentaje de bacterias que
sobreviven, mediante la razón entre el número de bacterias antes de la liofilización por gramo de material
seco y el número de bacterias por gramo de material seco que están presentes en el liofilizado [18, 19].
El estado de crecimiento bacteriano en el cual se produce la liofilización, es un parámetro importante que va
a afectar la sobrevivencia de las bacterias [18],ya que se ha demostrado que suspensiones bacterianas con un
alto número de células son menos afectadas en el proceso de liofilización [19]. Otra manera de contrarrestar
el efecto del proceso de liofilización es el uso de crioprotectores como se mencionó anteriormente [18].Por lo
tanto, el número de células en el cultivo bacteriano destinado a liofilizar y la evaluación del uso de crioprotec-
tores es necesaria para mantener un alto porcentaje de viabilidad en las células [17].
Otros parámetros importantes que también afectan la viabilidad de las células son la temperatura y el tiempo
de almacenaje de las muestras posterior a la liofilización [18, 19]. Estos parámetros han sido destacados por
algunos estudios que demuestran que las tazas de sobrevivencia aumentan a bajas temperaturas de alma-
cenaje, y el tiempo de almacenaje puede afectar con distinta intensidad a cada tipo bacteriano [18]. Algunos
autores han descrito que mediante el secado por congelamiento disminuye la viabilidad después del proceso
comparado con secado por pulverización.No obstante, este efecto es compensado debido a que la viabilidad
celular después del congelamiento es mantenida durante un mayor tiempo de almacenaje con respecto a la
pulverización [19].
VI. Materiales de referencia para microbiología de muestras de agua
Desarrollo de materiales de referencia aplicados a muestras de agua
Debido a que la mayoría de los estudios en esta área son realizados con fines comerciales por grandes labora-
torios de microbiología a nivel mundial, pocos trabajos relacionados con la producción de materiales de refe-
rencia aplicado a bacterias coliformes se han publicados hasta la fecha.Todos estos laboratorios trabajan en la
producción de precisos materiales de referencia para el área de la microbiología, los cuales deben proveer de
un número consistente de bacterias con una desviación estándar que no tenga una alta variación [16].Existen
algunos materiales de referencia comercialmente disponibles para microbiología pero no tienen un alto nivel
de precisión. Uno de ellos es el Quanti-cult (Oxoid,West Heidelberg, Australia), que son células liofilizadas por
congelamiento almacenadas en viales como un pellet semicuantitativo.Tienen un alto grado de variación en
el conteo de bacterias (100-1,000 unidades formadoras de colonias) y frecuentemente requiere de pasos de
dilución de la suspensión bacteriana. A pesar de esto es un producto amigable para manipular y puede ser
almacenado por un largo tiempo a -80
o
C [16].
El grupo de Morgan y col.(BTF Pty.Ltd.),desarrolló algunas metodologías para producir materiales de referen-
cia con un número preciso de biopartículas. Estas metodologías incorporan la citometría de flujo para dispo-
ner de cantidades específicas de bacterias viables que son secadas por congelamiento en presencia de crio-
protectores, y las bacterias liofilizadas forman una esfera sólida estable conteniendo la cantidad específica de
biopartículas. Ellos desarrollaron estándares precisos de alta calidad con un promedio de 30 células de varias
especies bacterianas. Dentro de estas se encuentra E. coli que puede ser cuantificada rápida y fácilmente por
conteo en placas. Con este producto los laboratorios pueden seguir sus procesos de análisis y compararlos
directamente con resultados obtenidos por otros laboratorios que han utilizado el mismo sistema [16].
Recientemente la empresa BTF Pty.Ltd.,desarrolló cultivos bacterianos que pueden ser utilizados como están-
dares de referencia, denominados BioBall
TM
, para evaluar las técnicas utilizadas para cuantificar E. coli y otras
bacterias coliformes encontradas en muestras de agua [21]. El BioBall
TM
es una esfera blanca de aproximada-
mente 3 milímetros de diámetro que contiene microorganismos viables producidos por una selección de 30
células mediante citometría de flujo, las cuales son depositadas en nitrógeno líquido y son congeladas por
congelamiento [16]. Estas suspensiones bacterianas liofilizadas fueron evaluadas con varios métodos usados
para la cuantificación de coliformes como FM, conteo en placas estándar, tecnología de sustratos definidos
