Materiales de referencia y comparaciones interlaboratorios
II. Aplicaciones y Desarrollo
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y gas (tabla 1).Se pueden encontrar en el suelo,agua,frutas,vegetales,
cereales, plantas, y animales desde insectos hasta humanos. Muchas
de estas especies pueden causar enfermedades como diarrea, infec-
ciones extraintestinales como la meningitis, e infecciones en tracto
urinario, respiratorias y en heridas. De ahí el interés de encontrar mé-
todos efectivos para su detección [4].
Cepas de bacterias entéricas de los géneros Escherichia y Enterobacter
son utilizadas en controles positivos y negativos para las determina-
ciones cualitativas y cuantitativas de coliformes o como control de
productividad y selectividad de los medios de cultivos usados. Las
diferencias metabólicas que presentan cada una de las especies son
utilizadas para analizar la pureza de cultivos bacterianos, el cual es
un paso importante para mantener y asegurar la calidad de las cepas
que son empleadas como controles en los ensayos para la determina-
ción de coliformes (Tabla 1).
Las bacterias pertenecientes al género Escherichia son bacilos Gram-
negativos, y presentan las características mencionadas para la familia
Enterobactericiae. Pero además, presentan otras características que
son particulares para este género como ser oxidasa negativo,catalasa
positivo, rojo de metilo positivo, Voges-Proskauer negativo, y usual-
mente citrato negativo (Tabla 1). Dentro de este género se encuentra
Escherichia coli, la cual es causante de diarreas y de infecciones en el
tracto urinario [4]. Las bacterias pertenecientes el género Enterobac-
ter son bacilos Gram-negativos, y también presentan las característi-
cas mencionadas para la familia Enterobacteriaceae.Pero además son
citrato positivo, la mayoría de las cepas son Voges-Proskauer positivo,
citrato e indol positivo, y pueden variar en la reacción de rojo de me-
tilo (Tabla 1). Muchas especies, dentro de las que se encuentra Ente-
robacter aerogenes, son patógenos oportunistas que causan infeccio-
nes del tracto urinario y ocasionalmente septicemia y meningitis [4].
En la mayoría de los laboratorios las distintas pruebas metabólicas
son preparadas en tubos que contienen cada medio a estudiar. No
obstante, en la actualidad existen algunos métodos más sofisticados
y sensibles para analizar la pureza de las cepas bacterianas. Una posi-
bilidad es el uso de galerías metabólicas,las cuales miden la presencia
o ausencia de enzimas involucradas en el catabolismo de diferentes
medios [5]. La galería API-20E (bioMériux) es un sistema estandari-
zado, compuesto de una tira plástica con 20 posillos que contienen
distintos sustratos deshidratados, utilizado para identificar Entero-
bacterias (fig. 1). Las galerías API son los ensayos más utilizados para
la identificación de cepas en laboratorios clínicos [6,7].
III. Detección y cuantificación de coliformes en aguas
Existen varios métodos tradicionales para la detección de coliformes
aprobados por diversos organismos técnicos, entre ellos, la técnica
de fermentación en tubos múltiples (FTM) y la técnica de filtración
en membrana (FM) [1]. A pesar de ser ampliamente utilizados, éstos
presentan limitaciones, tales como duración de las incubaciones, in-
Ensayo
Escherichia
coli
Enterobacter
aerogenes
Oxidasa
-
-
Producción de indol
+
-
Rojo de metilo
+
-
Voges-Proskauer
-
+
Citrato
-
+
Catalasa
+
+
Hidrólisis de urea
-
-
D-Glucosa, producción de
ácido
+
+
D-Glucosa, producción de gas
+
+
Lactosa, producción de ácido
+
+
Reducción de nitrato
+
+
Tabla 1. Resumen de las principales características
bioquímicas utilizadas para diferenciar bacterias de los
géneros
Escherichia
y
Enterobacter
[4].
Figura 1. Resultados entregados por la galería metabólica
API-20E (bioMérieux) usada para la identificación de
bacterias entéricas. Arriba, resultados para
Edwardsiella
hoshinae
. Abajo, resultados para
Enterobacter agglomerans
.
(imagen tomada de
).
terferencia de organismos antagónicos, ausencia de especificidad para
grupos de coliformes y débiles niveles de detección de bajas tasas de
crecimiento y de microorganismos estresados. Sumado a esto y depen-
diendo del ambiente, solo una pequeña porción (0,1-15%) del total de
una población bacteriana puede ser cuantificada por métodos basados
en el cultivo de los microorganismos [8].
IV. Métodos clásicos
La técnica de cuantificación de coliformes mediante la fermentación
de bacterias en tubos múltiples (FTM), ha sido utilizada durante más de
80 años para monitorear la calidad del agua. En Chile, existen normas
técnicas para la determinación de coliformes totales mediante el Méto-
do de Tubos Múltiples y Filtración por Membrana en aguas, desde 1984
[9]. El método de FTM consiste en la inoculación de una serie de tubos
con diluciones apropiadas de una muestra de agua. La producción de
gas, formación de ácido o abundante crecimiento después de incubar
48 horas a 35 o C constituye una reacción positiva presuntiva y los caldos
lactosa y lauril triptosa son usados como medios presuntivos (fig. 2A).
Todos los tubos positivos para el ensayo presuntivo deben ser sometidos
al ensayo de confirmación (fig. 2B). La formación de gas en un caldo bilis
lactosa verde brillante (fig. 2A), dentro de 48 horas a 35oC constituye
un confirmación positiva del ensayo para coliformes totales. Ahora, para
determinar cuales coliformes totales pueden ser fecales, es utilizado el
medio EC, el cual debe presentar producción de gas después de 24 ho-
ras de incubación a 44,5 o C para que sea considerado como positivo [8].
Los resultados de la fermentación por tubos múltiples son expresados
en términos del número más probable (NMP) de microorganismos pre-
sentes. Como consecuencia de esto, la técnica ofrece una enumeración
semi-cuantitativa de coliformes.Por lo tanto,la precisión de la estimación
es baja y depende del número de tubos usados en el análisis [1]. Muchos
factores pueden afectar significativamente la detección de coliformes
por NMP, especialmente durante la etapa presuntiva. Pueden existir in-
terferencias en las determinaciones debido a la presencia de bacterias
no coliformes, así como por una naturaleza inhibitoria del medio en que
crecen las bacterias. Por lo tanto, NMP carece de precisión en términos
cualitativos y cuantitativos [10]. A pesar de que el tiempo requerido para
obtener resultados es alto, el NMP es fácil de implementar y puede ser
realizada por un técnico con conocimientos básicos de microbiología.
Los costos son bajos, y se requiere de un laboratorio sin un equipamien-
to sofisticado [11].
El método de filtración por membrana (FM) también es una técnica sim-
ple y de bajo costo, es el método más utilizado en la determinación ruti-
naria de coliformes en agua. Este método consiste en filtrar una muestra
de agua en un filtro estéril con tamaño de poro de 0,45 μm que retiene
a las bacterias (fig. 3A), posteriormente el filtro es incubado en un me-
dio selectivo y las colonias típicas en el filtro son enumeradas. Muchos
medios y condiciones de incubación para FM han sido probados para
una recuperación óptima de coliformes. Entre estos, los más ampliamen-
te usados para el análisis de agua son el medio tipo-Endo y el medio
Tergitol-TTC. Las bacterias coliformes forman colonias rojas con una co-
bertura metálica en el medio tipo-Endo conteniendo lactosa (fig. 3B) y
colonias amarillo-naranjo en medio Tergitol-TTC, en este último caso con
una incubación durante 24 horas a 37 o C y 44 o C para coliformes totales y
coliformes fecales, respectivamente. También existen medios especiales
para detectar coliformes fecales a 44,5 o C (fig. 3C) [1].
