Materiales de referencia y comparaciones interlaboratorios
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Figura 2. Medios utilizados en la fermentación por tubos
múltiples para la determinación de coliformes totales. A,
medios lauril triptosa (izquierda) y bilis lactosa verde brillante
(derecha) utilizados para los ensayos presuntivo y confirmativos,
repectivamente. B, resultado de ensayo presuntivo positivo
(derecha) comparado con el medio lauril triptosa control (izquierda).
(Imagen tomada de
-
coliformtest.htm)
La cuantificación de coliformes totales mediante FM no es total-
mente específica debido a la posible aparición de colonias con ca-
racterísticas atípicas; por lo que es recomendada la verificación de
coliformes para este tipo de análisis [12]. Por otro lado, podrían exis-
tir algunos tratamientos químicos y físicos realizados en agua, que
pueden causar un daño subletal a las bacterias, resultando en un
daño celular que las haga incapaces de formar colonias en un medio
selectivo [1].La determinación de coliformes mediante FM tiene ven-
tajas significativas sobre FTM, debido a que pueden ser analizados
grandes volúmenes de muestra, aumentando la sensibilidad y realis-
mo de los datos. La FM ofrece un análisis cuantitativo comparado a
la información semi-cuantitativa otorgada por FTM.Además,pueden
ser procesadas unmayor número de muestras en un día con un equi-
pamiento de laboratorio limitado y un técnico con conocimientos
básicos en microbiología [1].
Nuevos métodos desarrollados
El estudio de nuevos ensayos ha sido desarrollado con el fin de dis-
minuir el tiempo en la obtención de resultados y aumentar la sensi-
bilidad en la cuantificación de coliformes en muestras de agua [1].
Técnica Inmunológica
Para la aproximación inmunológica,varios anticuerpos contra bacte-
rias coliformes han sido producidos como indicadores de la calidad
del agua. El uso de métodos inmunológicos para la detección de
microorganismos tienen la cualidad de ser rápidos y simples, y la ca-
lidad del ensayo depende de la especificidad del anticuerpo.Hasta la
fecha los ensayos inmunológicos no han sido satisfactorios, debido
a que altos niveles de microflora distinta a las coliformes pueden in-
terferir en la especificidad del método [1].
Amplificación de ADN
Las técnicas moleculares basadas en el análisis de ácidos nucleicos
utilizan como herramienta el reconocimiento de complementa-
riedad de secuencias entre una sonda y un ácido nucleico blanco.
Estos métodos entregan información taxonómica a distintos nive-
les, tales como clases, géneros, especies o subespecies, y permiten
la detección de bacterias específicas dentro de horas [1]. Una de las
técnicas utilizadas es el PCR, en donde un ADN blanco es amplifica-
do mediante una replicación cíclica, incrementando de esta forma
la posibilidad de detectar microorganismos que se encuentran en
baja abundancia en las muestras. La especificidad de detección de-
pende del grado de homología y complementariedad entre de las
secuencias de ADN [13]. Como ejemplo, las secuencias de los genes
que codifican para las proteínas -galactosidasa y -D-glucoronidasa,
han sido utilizadas para detectar coliformes totales y E. coli, respecti-
vamente [13,14].A pesar de que la detección de bacterias coliformes
por medio de amplificación de ácidos nucleicos utilizando PCR ha
dado resultados satisfactorios, esta técnica molecular carece de una
completa precisión y aun necesita desarrollarse completamente en
los laboratorios [1].
Figura 3. Método FM utilizado para la cuantificación de coliformes totales
y fecales. A, filtro de 0,45 µm sin uso. B, colonias rojas típicas obtenidas
al incubar el filtro en el medio tipo-Endo para la determinación de
coliformes totales. C, colonias azules típicas obtenidas al incubar el filtro
en el medio específico para la determinación de coliformes fecales.
( imagen tomada de
htm)
Hibridización in-situ
La hibridización in-situ (ISH) involucra el uso de sondas compuestas por oli-
gonucleótidos para detectar secuencias complementarias específicas dentro
de las células de distintos grupos bacterianos [1]. Generalmente, pueden ser
utilizadas sondas complementarias a los genes que codifican para los ARN
ribosomales 16S de distintas especies de la familia Enterobacteriaceae como
control de calidad de muestras de agua [15]. Este tipo de ensayo puede ser
una alternativa viable sobre los métodos convencionales de cultivos para la
determinación de bacterias coliformes, ya que presenta una alta sensibilidad
y entrega datos cuantitativos en un corto período de tiempo (6-8 horas). No
obstante, requiere de mayor inversión en los laboratorios, con respecto a la
utilización de métodos convencionales [1].
Los métodos moleculares aumentan la especificidad de detección y redu-
cen el tiempo de los análisis. Pero, a pesar de que muchos métodos han sido
desarrollados en el último tiempo, solo algunos tienen el potencial para con-
vertirse en un método estandarizado para detección de coliformes en las
muestras de agua,debido a las complejidades técnicas y costos que deberían
asumir los laboratorios.
V. Producción de materiales de referencia para el área de la microbiolo-
gía
Un material de referencia es un material o sustancia en que una o más de sus
propiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramente es-
tablecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato, la
evaluación de un método de medida o la asignación de valores a materiales
[Guía ISO 30:1992].El punto de mayor importancia para la producción de ma-
teriales de referencia que puedan ser utilizados en microbiología,es la mane-
ra en que las muestras son preparadas para su utilización,lo que tiene efectos
directos en las condiciones en que se mantienen las muestras con bacterias y
en la sobrevivencia de las bacterias al momento de ser utilizadas en los dife-
rentes ensayos.Desde los primeros trabajos desarrollados paramejorar la cali-
dad de los ensayos se trató de buscar los parámetros claves en el desarrollo de
materiales de referencia en microbiología, como el número de bacterias a al-
macenar,mediode cultivoutilizado,la temperatura y el tiempode almacenaje.
Métodos utilizados en la producción de los materiales de referencia
Para la producción de materiales de referencia en microbiología, es necesa-
ria una metodología que entregue un conteo exacto de microorganismos
viables y que las células sean dispensadas en un formato de fácil manejo y
puedan ser almacenadas por un largo periodo de tiempo [16].
El método más estudiado y utilizado para la producción de materiales de
referencia en microbiología es la liofilización de suspensiones bacterianas.
La liofilización es un secado que implica una pérdida de líquido como vapor
de agua al someter una muestra a una baja presión parcial de vapor. Desde
un punto de vista comercial han sido desarrollados una gran variedad de
metodologías para la liofilización de cultivos bacterianos. La mayoría de los
estudios tienen relación con la producción de polvos de bacterias ácido lác-
ticas que incluyen varias especies de Lactobacillus, los cuales son utilizados
en la industria de alimentos [18,19].
A
B
A
B
C
