III Simposio de Postgrado 2025: Ingeniería, ciencia e innovación

11 189 Evaluación de la coexpresión de una monooxigenasa y una deshidrogenasa putativa de actinomicetos del Lupino del Desierto de Atacama para la regeneración de cofactores en sistemas multienzimáticos Diego Flores Sepúlveda ¹ , ²* Carolina González ¹ , ² Sebastián Rodríguez ¹ , ² Irene Martínez ¹ , ² ¹ Departamento de Ingeniería Química, Biotecnología y Materiales, Universidad de Chile ² Centre for Biotechnology and Bioengineering CEBIB, Universidad de Chile *E-mail: diego.flores.2@ug.uchile.cl La utilización de enzimas como las fla - voproteínas monooxigenasas (FPMO) de clase B ha surgido como una al- ternativa más sustentable frente a los métodos sintéticos tradicionales en la producción de compuestos de interés industrial, tales como polímeros e in- termediarios farmacéuticos [1] . Estas proteínas son capaces de catalizar la incorporación de un átomo de oxígeno a un sustrato, utilizando nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) o nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) como donante de electrones. Considerando el elevado costo, el uso estequiométrico y la inestabilidad del NAD(P)H, resulta esencial disponer de un sistema de regeneración eficaz para la aplicación industrial de estas enzi- mas [2] . En este contexto, el objetivo de esta tesis es evaluar la coexpresión de una FPMO funcional junto a una deshi- drogenasa putativa, enzima capaz de regenerar NAD(P)H, en Escherichia coli. En primer lugar, se realizó una búsque- da bioinformática de deshidrogenasas mediante un BLAST local contra ge- nomas de diversos microorganismos aislados del Lupino del Desierto de Ata- cama, priorizando aquellas homólogas a enzimas de Lentilactobacillus kefiri y Levilactobacillus brevis , previamen- te estudiadas como regeneradoras de cofactores en sistemas multienzimá- ticos [2] . Dos genes fueron selecciona- dos y clonados en cuatro construccio- nes diferentes, utilizando los vectores pET22b(+) y pETDuet-1, y expresados en E. coli DH5 α para su validación ini- cial. Posteriormente, se evaluará la ex- presión heteróloga y actividad enzimá- tica de las deshidrogenasas putativas seleccionadas en cepas de E. coli que favorezcan su síntesis funcional. Finalmente, se evaluará la coexpresión de la FPMO seleccionada junto a una de las deshidrogenasas putativas, con- siderando la utilización de plásmidos in- dependientes y el sistema pETDuet. Se espera identificar combinaciones que permitan regenerar eficientemente el cofactor en estudio y, con ello, potenciar la actividad de las monooxigenasas en la industria de manera más sostenible. Resumen __Referencias [1] Bermúdez, E., Ventura, O. N., Eriksson, L. A., & Saenz-Méndez, P. (2014). Improved homology model of cyclohexanone monooxygenase from Acinetobacter calcoaceticus based on multiple templates. Computational Biology and Chemistry, 49, 14–22. https://doi.org/10.1016/ J.COMPBIOLCHEM. 2014.01.012 [2] Xiong, J., Chen, H., Liu, R., Yu, H., Zhuo, M., Zhou, T., & Li, S. (2021). Tuning a bi- enzymatic cascade reaction in Escherichia coli to facilitate NADPH regeneration for ε -caprolactone production. Bioresources and Bioprocessing, 8(1), 1–10. https://doi.org/10.1186/ S40643-021-00370-W/ TABLES/1